鼠尾胶原在心肌细胞氧化损伤中的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8463-8469.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.018

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鼠尾胶原在心肌细胞氧化损伤中的保护作用

包馨慧，李晓梅，陶静，杨毅宁，马依彤，陈邦党

新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-10-07 出版日期:2014-12-17 发布日期:2014-12-17
通讯作者: 李晓梅，副主任医师/副教授，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:包馨慧，女，1989年生，山东省临沂市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事心血管疾病基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81060021)

Rat tail tendon collagens protect cardiomyocytes against oxidative damage

Bao Xin-hui, Li Xiao-mei, Tao Jing, Yang Yi-ning, Ma Yi-tong, Chen Bang-dang

the First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-10-07 Online:2014-12-17 Published:2014-12-17
Contact: Li Xiao-mei, Associate chief physician, Associate professor, the First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Bao Xin-hui, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060021

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原蛋白具有抗氧化作用，但既往在实验室主要将鼠尾胶原用于促进细胞贴壁和支架构建，对于其抗氧化作用目前尚无相关研究。

目的：探讨鼠尾胶原对过氧化氢导致离体心肌细胞氧化损伤的保护作用。

方法：将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机接种到铺有鼠尾胶原的培养皿(实验组)和普通培养皿(对照组)中，并且均用0，10，100 µmol/L H₂O₂诱导。24 h后，以电子显微镜观察各组乳鼠心肌细胞的形态，应用MTT比色法检测心肌细胞存活率，TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态，流式细胞技术检测心肌细胞凋亡率，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活力，硫代巴比妥比色法检测丙二醛水平，Western-Blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达。

结果与结论：两组培养皿中，随着过氧化氢浓度的增高，均可见细胞凋亡状态明显加重，细胞存活率及细胞内过氧化氢活力明显下降，细胞凋亡率及细胞内丙二醛水平明显增高，Bcl-2/Bax比值显著降低，呈剂量依赖性。而在相同浓度过氧化氢诱导下，与对照组相比，实验组细胞凋亡状态明显减弱，细胞存活率、超氧化物歧化酶活力及Bcl-2/Bax比值增高，细胞凋亡率和丙二醛水平明显减低。表明鼠尾胶原对过氧化氢所致的心肌细胞氧化损伤具有保护作用，其机制可能与提高超氧化物歧化酶活力，减少丙二醛产生及提高Bcl-2的表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 鼠尾胶原, Ⅰ型胶原蛋白, 心肌细胞, 氧化应激, 过氧化氢, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although collagen has been approved to have antioxidant effect, there is no relevant research at the cell level. Previous experimental studies have focused on the effect of rat tail tendon collagens to promote cell adhesion and scaffold construction.

OBJECTIVE: To investigate the protective role of rat tail tendon collagen in oxidative stress of cardiomyocytes induced by hydrogen peroxide.

METHODS: Primary neonatal rat cardiomyocytes were seeded in culture dish with or without rat tail tendon collagen randomly, then both treated with various concentration of H₂O₂ (0, 10, 100 µmol/L) for 24 hours. Then, the morphology of cardiomyocytes was observed by inverted fluorescence microscope, the viability of cardiomyocytes wasmeasured by MTT assay, TUNEL was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes, the percentage of apoptotic cells was determined by flow cytometry, superoxide dismutase activity was detected by xanthine oxidase method, glucosinolates barbitone colorimetry was used to detect the contents of malonaldehyde and western blot assay was used to detect the expression of Bax and Bcl-2.

RESULTS AND CONCLUSION: With the increasing of the concentration of H₂O_2, cardiomyocytes cultured with or without rat tail tendon collagen were observed severer in apoptotic state; the cell viability and superoxide dismutase activity were significantly reduced; the percentage of apoptotic cells and content of malonaldehyde were significantly increased; the Bcl-2/Bax ratio was reduced in dose-dependent manner. In the same concentration of H₂O₂, compared with the cells cultured without rat tail tendon collagen, the apoptotic state of cells cultured with rat tail tendon collagen was significantly relieved, the viability of cardiomyocytes, superoxide dismutase activity and Bcl-2/Bax ratio were higher, and the apoptosis rate and malonaldehyde content were reduced. These findings indicate that rat tail tendon collagen can protect cardiomyocytes against H₂O₂ induced oxidative stress injury through improvement of superoxide dismutase activity and Bcl-2 expression and reduction of malonaldehyde content.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: collagen, myocytes, cardiac, hydrogen peroxide

中图分类号:

R318

包馨慧，李晓梅，陶静，杨毅宁，马依彤，陈邦党. 鼠尾胶原在心肌细胞氧化损伤中的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8463-8469.

Bao Xin-hui, Li Xiao-mei, Tao Jing, Yang Yi-ning, Ma Yi-tong, Chen Bang-dang. Rat tail tendon collagens protect cardiomyocytes against oxidative damage [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8463-8469.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态学观察 过氧化氢诱导24 h于显微镜下观察可见，与正常对照相比，过氧化氢诱导的心肌细胞形态学发生变化，细胞变细长，且随着过氧化氢浓度的增加细胞结构破坏越明显，细胞脱落增多，细胞分布稀疏，死细胞增加。而相同浓度过氧化氢诱导铺胶组相比未铺胶组细胞分布均匀，细胞脱落相对较少且细胞完整性相对较好 (图1)。TUNEL染色后可见随着过氧化氢浓度增加，凋亡细胞明显增多，而相同浓度下铺胶组凋亡细胞明显少于未铺胶组(图1)。

2.2 不同浓度过氧化氢对心肌细胞存活率、凋亡率、超氧化物歧化酶活力和丙二醛水平的影响 分别用10， 100 µmol/L过氧化氢处理心肌细胞24 h后，发现细胞生存率及培养液中超氧化物歧化酶活力呈依赖性下降，而细胞凋亡率及细胞蛋白裂解液中丙二醛水平呈依赖性上升(表1，图2)。

2.3 鼠尾胶原对过氧化氢诱导细胞损伤的影响 对铺有鼠尾胶原的心肌细胞分别用10，100 µmol/L过氧化氢诱导24 h后，虽然心肌细胞生存率、培养液中超氧化物歧化酶活力、细胞凋亡率及细胞蛋白裂解液中丙二醛水平的变化趋势与未铺胶组相同，但铺有鼠尾胶原的心肌细胞在相同浓度过氧化氢诱导下，心肌细胞生存率、培养液中超氧化物歧化酶活力明显高于未铺胶组(P < 0.05)，而细胞凋亡率以及细胞蛋白裂解液中丙二醛水平显著低于未铺胶组(P < 0.05)(表1，图2)。

2.4 心肌细胞凋亡蛋白的表达 Western-Blot检测凋亡蛋白表达发现，随着过氧化氢浓度的增高，Bcl-2/Bax呈剂量依赖性下降，而相同浓度过氧化氢诱导下铺胶组的Bcl-2/Bax比值要明显高于未铺胶组(P < 0.05)(图3，表1)。

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引言

胶原蛋白是在哺乳动物中广泛存在的大分子蛋白质，是动物体内细胞间隙中最重要也是含量最多的蛋白质。胶原蛋白是结缔组织、骨骼和皮肤的主要组成部分，起着支撑器官和保护机体的作用。胶原蛋白能参与细胞的物质代谢、迁移、分化和增殖，改善血液循环和生存环境，维持与修复组织细胞的正常生理功能，参与生命活动的整个过程，还具有诱导生长因子、促进生长发育、促进组织修复的能力^[1]。胶原蛋白在形成特定的细胞外微环境中起到重要作用，而这些微环境对维持细胞完整性及传递细胞外信号非常关键^[2-3]。胶原蛋白中含有丰富的营养物质，其水解产物中还含有丰富的生理活性肽，在保持、修复血管壁弹性，提高关节、软骨及韧带的润滑，减轻关节僵硬、酸痛和预防心脑血管疾病等方面有着独特功效^[1-4]。胶原蛋白因其可降解性、低抗原性、组织相容性等特点，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生邻域用途广泛^[5-6]，从临床早期的外科止血和创伤修复开始，逐步发展到临床各科室，如皮肤科中用于皮肤缺损修复与充填美容；口腔科中用于牙槽窝止血和黏合，牙周韧带、牙槽嵴增生等；心血管外科中的心脏瓣膜、血管移植物和血管穿刺孔密封装置；眼科的角膜罩、载药膜片、角膜移植物和视网膜附着物；耳科中的耳鼓膜修复用凝胶及膜片；泌尿科用于治疗尿失禁的充填物，吊带及尿管修复膜；矫形外科用于半月板修复与再生的胶原基质；跟腱替代与修复的胶原材料及前交叉韧带重建等诸多方面^[7-11]。

自由基是人体新陈代谢的中间产物，通过氧化其他分子从而破坏细胞结构，引起细胞凋亡，影响机体的生理功能。越来越多的证据证实自由基参与心血管系统的多种生理、病理过程，引发多种心血管疾病，如高血压病、动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌病等^[12]。近年来的研究发现胶原蛋白有抗氧化活性作用，适当摄入可以降低体内自由基水平，帮助机体抵抗疾病^[13]。目前对胶原蛋白抗氧化损伤的研究以水产胶原蛋白居多，而动物胶原蛋白尤其是肌腱来源的胶原蛋白较少。现已报道的27种胶原蛋白中，Ⅰ型胶原蛋白是体内普遍分布且在组织分布最广泛^[14]。鼠尾胶原属于Ⅰ型胶原蛋白，自提取以来主要用于促进细胞贴壁和组织工程中支架结构的构建。近年来研究发现，鼠尾胶原除了前面所提的作用外，还对细胞的生长分化、组织愈合及促进凝血等方面发挥重要的作用^[15-17]。介于鼠尾胶原属于胶原蛋白，推测鼠尾胶原对于氧化损伤也具有一定的保护作用。在此作者在细胞水平上，通过建立心肌细胞氧化损伤模型，研究鼠尾胶原对心肌氧化损伤的作用以及可能的机制。

本实验通过用低浓度和高浓度过氧化氢刺激体外培养的乳鼠心肌细胞来建立氧+化损伤模型，利用鼠尾胶原预处理培养皿，通过检测心肌细胞存活率、凋亡率、凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)的表达、超氧化物歧化酶活力及丙二醛的水平，来验证鼠尾胶原对体外心肌细胞的氧化损伤具有保护作用。

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材料方法

设计：对比观察细胞实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年4月在新疆医科大学第一附属医院冠心病实验室完成。

材料：

实验动物：新生1-3 d SD大鼠乳鼠，雌雄不拘；健康成年雄性SD大鼠，体质量220 g左右，由新疆医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准，实验方案获得新疆医科大学实验动物伦理委员会批准。

实验方法：

鼠尾胶原的制备和铺板：剪取成年雄性SD大鼠尾巴并洗净，体积分数75%乙醇浸泡5 min后将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段，抽出银色的尾腱。将尾腱剪断置于平皿中，用生理盐水浸泡后吸去生理盐水，将尾腱称质量。将尾腱置于平皿内剪碎，转移至三角烧瓶中，每克尾腱加入0.1%醋酸溶液50 mL，摇晃，使尾腱分布均匀，4 ℃放置1周。之后离心，4 000 r/min，10-15 min，吸取上清，分装成小瓶，4 ℃保存。

吸取鼠尾胶原，均匀平铺到培养皿中，覆盖即可，随后将多余的鼠尾胶原吸出回收。将铺好的培养皿敞开盖，于紫外灯下照射过夜，备用。

原代乳鼠心肌细胞的培养：将新生1-3 d SD大鼠乳鼠消毒后剪取心脏，在D-Hank’s中清洗后剪瓣，于0.1%胰酶中4 ℃过夜消化后中和弃上清液，再用0.08%Ⅱ型胶原酶反复消化至组织块消失，200目筛网滤过后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬后2次差速贴壁纯化，计数后加入Brdu，终浓度 0.1 mmol/L，将细胞接种于培养皿中培养48 h。

实验分组及干预：在原代乳鼠心肌细胞培养接种时，随机将心肌细胞接种于铺鼠尾胶原皿和未铺鼠尾胶原皿中，培养48 h后均用浓度为0，10，100 µmol/L的过氧化氢处理24 h。

细胞形态学检查：用过氧化氢诱导24 h后观察细胞形态，并且采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态。将处理过的细胞用PBS清洗一二遍，于室温下用40 g/L多聚甲醛固定1 h后，用PBS洗过后，于冰上用0.25% Triton X-100透化2 min，再次用PBS清洗1遍后加入配好的反应液，于 37 ℃湿润黑暗环境中孵育1 h后于倒置荧光显微镜下观察。

细胞存活率检测：采用MTT比色法检测心肌细胞存活率。将心肌细胞以3×10⁵/孔接种于96孔板中，按实验分组进行相应处理，过氧化氢处理24 h，按说明书每孔加入MTT溶液4 µL，于二氧化碳培养箱中孵育4 h后每孔加入100 µL溶液，摇床低速振荡10-30 min使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪于570 nm波长检测各孔吸光度(A值)，按试剂盒说明书计算细胞存活率。

流式技术检测细胞凋亡率：过氧化氢处理24 h后，将贴壁心肌细胞用0.25%胰酶消化，反复吹打成单细胞悬液后1 600 r/min离心5 min后弃上清液，用PBS洗1遍后弃上清液，用100 µL结合缓冲液重悬，加入2 µL Annexin V-FITC标记液和2 µL PI液，混匀避光，孵育10 min。设Annexin V-FITC和PI单标样本。流式细胞仪测定各组心肌细胞凋亡率。

黄嘌呤氧化酶法检测培养液中超氧化物歧化酶活力：其原理是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基后氧化羟胺形成亚硝酸盐，加入显色剂后呈紫红色，用可见光光度计测其吸光度值。过氧化氢处理24 h后，当样品中含超氧化物歧化酶时，可特异性抑制超氧阴离子自由基的产生，从而减少硝酸盐形成。样品中超氧化物歧化酶活力按试剂盒公式计算。

硫代巴比妥比色法检测细胞蛋白裂解液中丙二醛水平：过氧化氢处理24 h后，通过过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸结合形成红色产物，用可见光光度计测其吸光度值带入试剂盒公式中计算样本细胞蛋白裂解液中丙二醛的浓度。

Western-Blot检测凋亡蛋白表达：过氧化氢处理24 h后，将贴壁心肌细胞用PBS洗过2遍后置于冰上，加入 100 µL裂解液，用刮匙将贴壁细胞刮下，收集于1.5EP管中，冰上裂解1 h后再于超声波细胞粉碎机中裂解， 13 000 r/min离心10 min(4 ℃)，吸取上清液保存。蛋白定量后每组均以40 µg上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，后经转膜、1-抗、2抗及显色后照相并用软件分析条带。

主要观察指标：各组心肌细胞存活率、凋亡率、凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)的表达、超氧化物歧化酶活力及丙二醛的水平。

统计学分析：实验数据采用x(_)±s表示。应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用LSD法。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

本实验分别以低浓度(10 µmol/L)和高浓度 (100 µmol/L)过氧化氢作用于原代乳鼠心肌细胞，模拟体外心肌细胞氧化应激状态。心脏维持正常功能需要大量的氧供应，但同时心脏对氧自由基的毒性也十分敏感。氧自由基主要以脂质、蛋白质以及核酸为攻击靶点，对心血管系统的结构和功能具有破坏作用^[18]。近年来研究表明氧化应激在高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心肌重构、心力衰竭等过程中具有重要病因学意义^[12]。氧化应激能引起心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡参与许多生理和病理生理过程，是多种心血管疾病发生与演变的细胞学基础^[18]。本实验发现在相同浓度过氧化氢诱导下，铺胶组的凋亡率明显低于未铺胶组，证实鼠尾胶对低浓度和高浓度过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡均有保护作用。

超氧化物歧化酶是细胞中主要的抗氧化酶，普遍存在于细胞胞液和线粒体中。超氧化物歧化酶能通过歧化作用清除氧自由基，维持机体的氧化和抗氧化平衡，保护细胞免受氧化损伤。当心肌细胞处于氧化应激状态时，细胞内超氧化物歧化酶的活性降低，细胞内堆积的氧自由基攻击细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸和脂肪酸的不饱和双键，引起脂质过氧化反应，产生以丙二醛为主的脂质过氧化物^[19]。丙二醛可引起细胞膜的通透性增高、流动性降低、线粒体肿胀及溶酶体破坏，进一步加重心肌细胞损伤。细胞内超氧化物歧化酶活力可间接反映清除氧自由基的能力，丙二醛水平则可间接反映细胞受自由基攻击的严重程度^[20]。本实验发现心肌细胞在经过氧化氢处理后，存活率及超氧化物歧化酶活力降低，凋亡率、Bcl-2/Bax比值及丙二醛水平升高，提示心肌细胞氧化损伤模型建立成功。

bcl-2是第一个被发现的与凋亡有关的基因，随着研究的不断深入，发现bcl-2家族既能促进细胞凋亡(bax、bad等)，也可抑制细胞凋亡(bcl-2、bcl-XL等)，其中，bcl-2/bax起主要的调节作用^[21]。Bcl-2蛋白的上调表达可以对抗细胞凋亡，有研究表明，bcl-2基因通过与线粒体中超氧化物歧化酶的相互作用可抑制凋亡^[22]。近年来的研究表明，Bcl-2可减少氧自由基的产生^[23]。Stcinman^[24]认为Bcl-2本身可以作为一种氧化原刺激细胞内源性抗氧化能力的增强，从而抑制细胞凋亡进程。目前认为Bcl-2抗凋亡的机制可能与其具有稳定线粒体膜、抑制线粒体释放促凋亡蛋白(如细胞色素C)、抑制caspascs激活和核酸内切酶对DNA的降解等作用有关^[10]。本实验发现在过氧化氢诱导引起的心肌细胞氧化损伤中，铺胶组的Bcl-2/Bax比值明显要高于未铺胶组，可见鼠尾胶能引起Bcl-2/Bax比值的上调，以此来发挥抗氧化应激的作用。

以往细胞水平研究发现胶原蛋白对多种细胞氧化损伤具有保护作用，在采用ox-LDL建立体外培养的人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)损伤模型的研究发现，胶原蛋白能显著抑制ox-LDL对血管内皮细胞的损伤并促进血管内皮细胞增殖，降低细胞内丙二醛含量并促进NO释放，证实胶原蛋白具有保护血管内皮细胞，预防动脉粥样硬化发生的作用^[25]；在采用过氧化氢处理高分化大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PCI2)建立氧化应激损伤神经细胞体外模型的研究中发现，胶原蛋白多肽能显著抑制错氧化氢对PCI2的损伤并促进细胞增殖，降低细胞内ROS水平、减少乳酸脱氢酶释放，提高细胞超氧化物歧化酶水平，提示胶原蛋白拮抗氧化应激损伤神经细胞的作用与清除活性氧自由基有关^[26]；在建立紫外线(UVA)氧化损伤L929细胞模型的研究中发现，Ⅰ型胶原蛋白防止UVA对L929细胞的氧化损伤，显著降低细胞内丙二醛活性、提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性^[27]。在动物水平的研究中发现，胶原蛋白能改善动物血脂水平，提高血清和肝脏中超氧化物歧化酶和GSH-px活性、降低丙二醛活性^[28-30]。

本实验用实验室常见胶原蛋白-鼠尾胶原来研究其在细胞氧化损伤中的作用及可能机制，发现鼠尾胶原可抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，提高心肌细胞存活率、细胞内超氧化物歧化酶的活力以及提高Bcl-2的表达，抑制丙二醛的生成，对低浓度和高浓度的过氧化氢均起作用。关于鼠尾胶原抗心肌细胞氧化应激损伤的机制目前尚未有相关报道，本实验首次在细胞水平证实了胶原蛋白对过氧化氢导致的心肌氧化损伤具有保护作用，结果提示其机制可能是鼠尾胶原通过提高超氧化物歧化酶活力来减少丙二醛的生成，降低氧自由基对心肌细胞的损伤，并且通过提高Bcl-2的表达抑制心肌细胞凋亡，从而发挥保护作用，而其中所涉及的具体的信号通路，则有待于进一步研究。

氧化应激在心脏疾病的形成和发展中有重要的病理学意义，也是造成缺血再灌注损伤的主要原因。缺血心肌再灌注治疗是急性心肌梗死的主要治疗手段，而在心肌的再灌注过程中易发生再灌注损伤，显著降低了再灌注治疗的效益。再灌注损伤的发生的主要机制目前认为主要是氧自由基的生成，因此降低再灌注过程中的氧化损伤对减轻再灌注损伤具有重要的意义。本实验发现鼠尾胶原能抵抗过氧化氢引起的心肌细胞氧化损伤，这为胶原蛋白在心脏疾病的治疗提供了理论依据，为心脏疾病治疗活性物质的开发开辟新的邻域。同时，研究结果表明，鼠尾胶原这一实验室中常见的胶原蛋白的价值不仅仅局限于促进细胞贴壁功能上，这一发现可能为鼠尾胶原作为新型生物材料在组织工程中的应用发挥更大的价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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鼠尾胶原在心肌细胞氧化损伤中的保护作用

Rat tail tendon collagens protect cardiomyocytes against oxidative damage

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